Une nouvelle technique pour repérer des mutations ponctuelles sur un gène

Une nouvelle technique de biologie moléculaire pourrait faciliter la réalisation de certains tests génétiques tels que la détection de mutations ponctuelles. Nommée SISAR (serial invasive signal amplification), cette technique diffère totalement de la PCR (réaction en chaine à la polymérase) et permet de générer 10 millions de molécules reportrices pour chaque molécule d'ADN analysée.

Cette nouvelle technique mise au point par V. Lyamichev et ses collègues de Third Wave Technologies (Madison, Wisconsin) est décrite dans la revue Proceedings of the National Academy of Sciences qui paraitra le 18 juillet.

La PCR, qui consiste à amplifier plusieurs milliards de fois une séquence d'ADN, est aujourd'hui une technique largement utilisée aussi bien dans le domaine de la biologie moléculaire que dans le domaine biomédical et notamment le diagnostic. Cependant, ce mode d'amplification exponentielle comporte certaines limitations comme les risques de contamination par des acides nucléiques indésirables qui peuvent conduire à des "faux positifs". De plus, les analyses quantitatives par PCR et la détection de petites variations génétiques restent délicate. Ces problèmes peuvent être contournés mais les solutions augmentent généralement la complexité et le coût des analyses, ce qui rend la PCR moins attractive pour des analyses spécifiques à grande échelle.

Une nouvelle technique de détection de l'ADN (nommée invasive signal amplification) a été récemment développée. Elle consiste à générer des molécules reportrices qui signalent la présence de l'ADN plutôt qu'à amplifier le gène lui-même. Cependant, cette technique était moins sensible que la PCR et générait moins de molécules reportrices par molécule d'ADN cible.

Les chercheurs de Third Wave Technologies ont amélioré cette technique tout en conservant son principe initial. Baptisée SISAR (serial invasive signal amplification), elle permet la détection d'une mutation ponctuelle sur un gène.

Brièvement, elle utilise 2 sondes (spécifiques de la mutation recherchée) qui se fixent sur deux séquences de l'ADN cible. Selon la structure de ce complexe, une nucléase peut cliver ou non une des deux sondes qui constitue alors la molécule reportrice.

Cette réaction étant totalement dépendante de la structure du complexe, elle permet de distinguer deux échantillons d'ADN qui ne diffèrent que par un seul nucléotide.

La molécule reportrice se fixe alors sur une troisième sonde (d'où le terme "serial") qui sous l'action de la nucléase génére un marqueur fluorescent facilement quantifiable. L'intensité du signal de fluorescence émis est donc directement dépendant de la quantité de molécule reportrice et donc de la quantité d'ADN étudié.

Selon les auteurs, la technique SISAR permet de détecter une mutation ponctuelle et génère plus de 10 millions de molécules reportrices pour chaque séquence d'ADN cible en 4 heures de réaction. Cette technique permet de détecter 600 copies d'un même gène dans un échantillon comparable à celui d'une prise de sang. Enfin cette technique très sensible est réalisée à température constante, contrairement à la PCR.

Les chercheurs indiquent dans leur conclusion que les améliorations apportées font que ce test pourraient être utilisé pour des analyses automatisées de mutations ponctuelles.

Source : PNAS 2000;97:8272-8277